Estudio del ecosistema rumial y la producción de proteína microbiana mediante pcr a tiempo real

Resumen

Los objetivos generales de la presente tesis doctoral fueron: Poner a punto técnicas moleculares que permitan estudiar el ecosistema ruminal y sus factores de variación. Validar la utilización de secuencias de ADN microbiano como marcador de la producción de proteína microbiana en el rumen. Para conseguir estos objetivos se diseñaron una serie de experiencia cuyos fundamentos y resultados pasamos a detallar. En primer ensayo se estudió la persistencia de la integridad de las secuencias de ADN microbiano tras la digestión abomasal, para ello se realizó una digestión in vitro bajo diferentes condiciones. En dicho ensayo se observó que al someter el ADN de microorganismos ruminales a una digestión abomasal in vitro, las secuencias de'ADN sufren una degradación proporcional a la acidez del medio y al tiempo de incubación. La concentración de pepsina no afecta a la integridad del ADN y la presencia de fibra ejerce un efecto protector sobre dichas secuencias de ADN microbiano. Cerca del 100% de las secuencias de AND bacteriano y aproximadamente el 78% de las origen protozoario son capaces de soportar una digestión abomasal a pH 2,3 en presencia de pepsina y fibra durante un tiempo de incubación de 40 minutos. La digestión abomasal de secuencias de ADN pertenecientes a diversas especies bacterianas es independiente del tipo de pared bacteriana y de su actividad, aunque existe una estrecha relación entre dicha degradación y el tamaño del fragmento amplificado.En el segundo esayo se estudió validó la utilización de dichas secuencias de ADN microbiano para el estudio del ecosistema ruminal y la síntesis microbiana en corderos en diferentes fases de producción (lactantes, al destete y al final de cebo) concluyendo lo siguiente: La elevadacorrelación entre los recuentos ópticos de protozoos y la concentración de ADN protozoario determinada mediante PCR a tiempo real avalan la validez de esta última metodología para la evaluación cuantitativa de las especies ruminales. En corderos Rasos sometidos a un régimen de alimentación intensiva la colonización protozoaria del rumen no es un proceso continuo. La PCR cuantitativa mostró que la colonización ruminal por R. albus, R. flavefaciens, P. ruminicola y S. bovis ocurre a edades muy tempranas incluso en animales recibiendo una alimentación láctea. Una vez instauradas estas poblaciones su abundancia relativa no se modificó con la edad del animal ni el tipo de dieta. En base al análisis mediante DGGE, la biodiversidad bacteriana ruminal experimenta un incremento proporcional al desarrollo del numen. Los corderos lactantes presentaron una flora particular caracterizada por una baja diversidad. Por contrario, la presencia de protozoos ruminales incrementó la diversidad bacteriana en corderos en cebo. Independientemente del marcador de flujo y marcador microbiano utilizado, el muetreo abomasal origina resultados más consistentes y menos variables que los obtenidos a partir de muestras duodenales. El desarrollo del reticulo-rumen origina un incremento de la contribución microbiana al N abomasal, siendo dicha evolución similar utilizando bases púricas o secuencias de ADN como marcadores microbianos. Además, las secuencias dé ADN permiten discernir entre la contribución bacteriana y protozoaria, representando ésta última población el 9,3% del N microbiano en los corderos al final del cebo. A partir de nuestros resultados obtenidos mediante DGGE no podemos confirmar la existencia de una retención ruminal de los microorganismos estudiados. En el último ensayo se estudió el efecto de la dieta y la ausencia de protozoos ruminales sobre la síntesis de proteína microbiana obteniendo las siguientes conclusiones: La ausencia de protozoos ruminales origina una reducción la digestibilidad de la fibra neutro y ácido detergente en 5.1 y 4.0 unidades porcentuales, lo que ocasiona una disminución en la digestión de la materia seca y orgánica en 2.0 puntos respectivamente. La ausencia de protozoos ruminales afecta a la fermentación ruminal originando una disminución de la concentración de amonio y ácidos grasos volátiles. La utilización de secuencias de ADN y el marcaje con 15N originan similares estimaciones de la síntesis de proteína microbiana. Ello confirma la validéz de dichas secuencias como marcador microbiano a nivel abomasal. Con independencia del marcador microbiano utilizado, la eficiencia de síntesis microbiana disminuyó tanto en presencia de protozoos, como con la suplementación con cebada, aunque estas últimas diferencias sólo fueron evidentes utilizando las bacterias de la fase líquida como extracto de referencia. El uso de de secuencias de ADN como marcador microbiano permite determinar el aporte post-ruminal de N bacteriano y protozoario. La contribución protozoaria es relevante aunque esta siempre influenciada poirla dieta. En los corderos alimentados con alfalfa el N protozoario representó el 1,5-1,6 % del flujo de N microbiano, alcanzando el 8,4-12,6 % bajo dietas suplementadas con cebada.