Reactivacion de genes mediante desmetilacion dirigida del adn

Resumen

Introducción y contenido de la investigación La metilación de la citosina en el carbono 5 del anillo de pirimidina (5-meC) es una marca epigenética estable, pero reversible, que promueve el silenciamiento génico transcripcional, participando así en la regulación de la expresión génica y el control de la diferenciación celular (Hsieh and Fischer, 2005). La alteración de los patrones de metilación del ADN es un componente fundamental de muchas enfermedades humanas, y en particular en muchos tipos de cáncer, que con frecuencia muestran una metilación aberrante (Esteller, 2007; Jaenisch and Bird, 2003). Los niveles de metilación son controlados y modificados por mecanismos de desmetilación que aún no se conocen con exactitud en células humanas (Roldan-Arjona and Ariza, 2009; Wu and Zhang, 2010). Sin embargo, en plantas, estudios bioquímicos y genéticos han demostrado la existencia de una familia de ADN glicosilasas capaces de escindir directamente la 5-meC del ADN, generando un sitio abásico que ha de ser procesado y reemplazado por una citosina no metilada mediante un mecanismo análogo a la ruta de reparación por escisión de bases (Base Excision Repair, BER) (Choi et al., 2002; Gong et al., 2002; Morales-Ruiz et al., 2006). Las principales representantes de estas ADN glicosilasas son la proteínas de Arabidopsis thaliana DEMETER (DME) (Choi et al., 2002; Kinoshita et al., 2004) y REPRESOR OF SILENCING 1 (ROS1) (Gong et al., 2002). El primer objetivo de esta tesis ha sido determinar si la expresión de DME en células humanas inicia un proceso de desmetilación activa, modificando el estado de metilación y el nivel de expresión de genes que se encuentran hipermetilados en células cancerosas. Para ello, se han obtenido transfectantes estables que expresan la proteína DME en la línea de cáncer de colon DLD-1. Los resultados indican que la expresión de DME conlleva la desmetilación de algunos genes y ésta se correlaciona con un aumento en su nivel de transcripción. Además, la presencia de DME en esta línea tumoral provoca una mayor sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos oxaliplatino y 5-FU, una menor capacidad de formar colonosferas y un menor crecimiento tumoral en xenoinjertos obtenidos en modelos murinos (Morales-Ruiz et al., 2018). El segundo de los objetivos de esta tesis consistió en el desarrollo de una herramienta molecular que permita dirigir las 5-meC ADN glicosilasas a regiones específicas del genoma de mamíferos. Para ello, se ha utilizado la tecnología CRISPR, fusionando el dominio catalítico de ROS1 a una versión defectiva de la endonucleasa Cas9 (dCas9-ROS1) que es guiada a secuencias específicas de ADN por pequeñas moléculas de ARN (ARNs guía). Los resultados indican que la expresión del sistema de edición epigenética dCas9-ROS1 en células HEK-293 es capaz de reactivar distintos genes reporteros (luciferasa y GFP) silenciados previamente por metilación, así como inducir la desmetilación parcial de los genes endógenos INS y OCT4. La actividad catalítica de dCas9-ROS1 se ve afectada por la densidad de la metilación en la región diana y su rango de acción está limitado a las primeras 50 pb respecto al sitio de unión del ARN guía. Conclusiones 1) La expresión de DME en células tumorales DLD-1 causa pérdida de metilación en los loci hipermetilados ROR2, p14 y p16 y reactiva su expresión. 2) La expresión de DME induce cambios en características fenotípicas de las células DLD-1 relacionadas con el proceso tumoral. 3) La expresión transitoria de dCas9-ROS1 en células humanas HEK-293 induce la desmetilación y reactivación dirigida de genes silenciados por metilación en un proceso independiente de la replicación de ADN. 4) El efecto reactivador de dCas9-ROS1, así como el de otros efectores fusionados a dCas9, disminuye con la densidad de la metilación. Bibliografía Choi, Y. H., Gehring, M., Johnson, L., Hannon, M., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Jacobsen, S. E., and Fischer, R. L. (2002). DEMETER, a DNA glycosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed viability in Arabidopsis. Cell 110, 33-42. Esteller, M. (2007). Epigenetic gene silencing in cancer: the DNA hypermethylome. 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