Valor del estudio citométrico del contenido en ADN y fase s en los Pólipos Colónicos con cancer focal. Papel de la apoptosis en la secuencia adenoma-cancer de colon.

Resumen

INTRODUCCIÓ Els tumors malignes són la primera causa de mort als països desenvolupats. El càncer colorectal (CCR) és la neoplàsia del tub digestiu més freqüent. Es diagnostiquen 20.000 nous casos de CCR a Espanya a lany, i afecta a un de cada 10.000 espanyols. Mostra una incidència creixent i suposa el 15% dels nous diagnòstics de càncer. Els esforços investigadors es centren en la prevenció i cerca de noves possibilitats terapèutiques. Sembla evident el paper què els processos de proliferació, diferenciació i destrucció cellular juguen en el desenvolupament de les neoplàsies i en el disseny de futures estratègies diagnòstiques i terapèutiques. Pocs articles en la literatura han demostrat interès per lestudi de la proliferació cellular i la mort cellular programada de les lesions preneoplàsiques del còlon. En la última dècada alguns treballs han investigat el paper que diversos oncogens, gens supressors de tumor, marcadors de proliferació cellular i inhibidors de la mateixa juguen en el desenvolupament de lesions canceroses a partir dun pòlip adenomatós colorectal preexistent. De tots ells destaca per les seves possibles aplicacions diagnòstiques i terapèutiques els dedicats a lestudi citomètric del contingut dADN en la seqüència adenoma-càncer colorectal, encara que la seva importància no ha estat demostrada de forma concloent. Lestabliment definitiu del paper que juga la inhibició de lapoptosi en lesmentada seqüència podria condicionar el maneig clínic futur dels pacients amb pòlips adenomatosos colorectals. Aquest treball pretén valorar de forma simultània la influència del contingut dADN i la inhibició de la mort cellular programada en la seqüència adenoma càncer colorectal, i fer una correlació dambdues amb variables clinicodemogràfiques i antomopatològiques. HIPÒTESIS 1. Lestudi del contingut dADN i proliferació cellular per citometria de flux pot ser un indicador important per al diagnòstic precoç de transformació maligna dels pòlips colorectals. 2. El fracàs o inhibició de lapoptosi pot conduir a la formació de pòlips colorectals i a la seva transformació maligna. MATERIAL I MÈTODES Estudio retrospectiu. Mostres: 134 vàlides obtingudes a partir de blocs parafinats procedents de pòlips colorectals extrets per polipectomia endoscòpica des de 1996 fins 2001 (22 adenomatosos, 94 tubulovellosos, 18 vellosos). En 33 pòlips es va detectar adenocarcinoma intramucós (16) o invasor (17). Controls: 128 biòpsies endoscòpiques de mucosa normal que es corresponen als quatre segments dintestí gros (36 a còlon ascendent, 32 a còlon transvers, 31 a còlon descendent, 29 a recte-sigma). Processament i anàlisi per citometria de flux del contingut dADN i fases del cicle cellular, amb tècnica de Hedley modificada. Contatge mitjançant un citòmetre de flux EPICS PROFILE I. Estudi dapoptosi: protocol de tinció sobre talls de 4 ?m amb el mètode TUNEL modificat; contatge cellular segons criteris predeterminats, i càlcul de líndex dapoptosi (IA). Els resultats obtinguts es van correlacionar amb variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques. En les mostres en les quals coincidien una porció adenomatosa i una altra neoplàsica en el mateix pòlip es van diferenciar ambdues seccions. RESULTATS -Mucosa normal: al recte-sigma vam trobar el menor índex de proliferació cellular (p<0,001) i en aquesta mateixa localització en el terç superior glandular és on existeix major índex dapoptosi (p=0,009). -Pòlips sense càncer focal: els pòlips amb diploidia són els que presenten major índex dapoptosi (p=0,05). De forma global lI.A. és major en la zona superior glandular i disminueix de forma progressiva fins a ser mínim en la zona inferior (p<0,001). La major distribució de lapoptosi correspon a la zona superior dels pòlips amb displàsia moderada i a la zona inferior dels pòlips dentre 1 i 2 cm. (p=0,02). -Pòlips amb càncer focal: en menors de 65 anys presenten major índex dapoptosi (p=0,02). De forma global el IA és major en la zona inferior (p=0,014). No hi ha relació entre la distribució de lapoptosi i les variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques tan en la porció adenomatosa com en la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal. Al comparar la porció adenomatosa i la tumoral, el major índex de proliferació (major % fase S) correspon a la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal invasor (p=0,039); no hi ha diferències significatives en la distribució i líndex dapoptosi. Els pòlips amb càncer focal intramucós amb histologia túbulo-vellosa són els que tenen major IA (p=0,035). En els pòlips amb càncer focal invasor els majors índexs dapoptosi sobserven en els dhistologia túbulo-vellosa (p=0,03), grandària menor d1cm (p=0,002) i menors de 65 anys (p=0,02). -Comparació mucosa normal versus pòlips sense i amb càncer focal: el major índex de proliferació sobté en el grup de pòlips amb càncer focal i els subgrups intramucós i invasor tan en les seves porcions adenomatoses com tumorals (p<0,001). Líndex dapoptosi total, per zones, i la distribució de lapoptosi per zones són majors en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001). -Comparació mucosa normal versus pòlips sense càncer focal: els pòlips sense càncer focal tenen major índex de proliferació, essent una variable predictiva independent (p<0,001). La distribució de lapoptosi per zones i líndex dapoptosi total i per zones també és major en els pòlips sense càncer focal però en aquest cas només té valor predictiu independent en els terços mig (p<0,001) i inferior (p=0,001). -Comparació mucosa normal versus pòlips amb càncer focal: els pòlips amb càncer focal tenen major índex de proliferació, tan en la porció adenomatosa com tumoral, que el grup de mostres normals, amb valor predictiu independent (p=0,003). La distribució i líndex dapoptosi, ambdós per zones, són majors en la zona superior del grup de mostres normals (p=0,007) i en la zona inferior del grup de pòlips amb càncer focal (p=0,007). Les esmentades variables tenen valor predictiu independent. -Comparació pòlips adenomatosos versus pòlips amb càncer focal: els segons presenten major percentatge daneuploidia (p<0,001), sense diferències a líndex de proliferació. El IA total és superior en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001), de la mateixa manera que la distribució i IA en els terços superior i mig (p<0,001), amb valor predictiu independent tan si es considera la part adenomatosa com la part tumoral dels pòlips amb càncer focal. La menor apoptosi en el terç superior dels pòlips amb càncer focal pressuposa transformació maligna. Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part adenomatosa dels pòlips amb càncer focal, les variables grandària major de 2 cm (p=0,027), displàsia severa (p=0,036) i presència daneuploidia (p=0,043) tenen valor predictiu independent, i suggereixen la presència de transformació maligna. Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part tumoral dels pòlips amb càncer focal només les variables grandària major de 2 cm (p=0,017) i presència daneuploidia (p=0,005) tenen valor predictiu independent per indicar transformació maligna. CONCLUSIONS El major percentatge de cèl.lules en fase S junt amb laneuploidia constitueixen un indicador precoç, amb valor predictiu independent, de transformació maligna dels pòlips colorectals. Els pòlips amb càncer focal, intramucós o invasor, presenten un índex dapoptosi major en la zona inferior glandular, essent una variable amb valor predictiu independent de transformació maligna. Les variables grandària > 2 cm., displàsia severa, aneuploidia i major índex dapoptosi en la zona inferior glandular, totes elles amb valor predictiu independent, permeten diferenciar entre els pòlips amb i sense càncer focal. La inhibició de lapoptosi afavoreix el creixement dels pòlips colorectals així com la seva transformació maligna. RESUMEN INTRODUCCIÓN Los tumores malignos son la primera causa de muerte en los países desarrollados. El cáncer colorrectal (CCR) es la neoplasia más frecuente del tubo digestivo. Se diagnostican 20.000 nuevos casos de CCR en España cada año, y afecta a uno de cada 10.000 españoles. Muestra una incidencia creciente, y supone el 15% de los nuevos diagnósticos de cáncer. Los esfuerzos investigadores se centran en la prevención y la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas. Parece evidente el papel que los procesos de proliferación, diferenciación y destrucción celular juegan en el desarrollo de las neoplasias y en el diseño de futuras estrategias diagnósticas y terapéuticas. Pocos artículos en la literatura han demostrado su interés por el estudio de la proliferación celular y la muerte celular programada de las lesiones preneoplásicas del colon. Durante la última década algunos trabajos investigan el papel que diversos oncogenes, genes supresores de tumor, marcadores de proliferación celular e inhibidores de la misma juegan en el desarrollo de lesiones cancerosas a partir de un pólipo adenomatoso colo-rectal preexistente. De todos ellos destacan por sus posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas los dedicados al estudio citométrico del contenido de ADN celular en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, aunque su importancia no se ha demostrado de forma concluyente. El establecimiento definitivo del papel que juega la inhibición de la apoptosis en dicha secuencia podría también condicionar el manejo clínico futuro de los pacientes afectos de pólipos adenomatosos colo-rectales. El presente trabajo pretende valorar de forma simultánea la influencia del contenido de ADN celular y la inhibición de la muerte celular programada en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, correlacionando ambaos con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas. HIPÓTESIS 1. El estudio del contenido de ADN y proliferación celular por citometría de flujo puede ser un indicador importante para el diagnóstico precoz de transformación maligna de los pólipos colorrectales. 2. El fracaso o inhibición de la apoptosis puede conducir a la formación de pólipos colorrectales así como a su transformación maligna. MATERIAL Y MÉTODOS Estudio retrospectivo. Muestras: 134 válidas obtenidas a partir de bloques parafinados procedentes de pólipos colorrectales extraídos por polipectomía endoscópica desde 1996 hasta 2001 (22 adenomatosos, 94 túbulo-vellosos, 18 vellosos). En 33 pólipos se detectó adenocarcinoma intramucoso (16) o invasor (17). Controles: 128 biopsias endoscópicas de mucosa normal correspondientes a los cuatro segmentos de intestino grueso (36 a colon ascendente, 32 a colon transverso, 31 a colon descendente, 29 a recto-sigma). Procesado y análisis mediante citometría de flujo del contenido de ADN y fases del ciclo celular, con técnica de Hedley modificada. Contaje mediante un citómetro de flujo EPICS PROFILE I. Estudio de apoptosis: protocolo de tinción sobre cortes de 4 ?m con método TUNEL modificado; contaje celular siguiendo criterios predeterminados, y cálculo del índice de apoptosis (IA). Los resultados obtenidos se correlacionaron con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas. En las muestras en las que una porción adenomatosa y otra neoplásica coincidían en el mismo pólipo se diferenciaron ambas secciones. RESULTADOS -Mucosa normal: en recto-sigma encontramos el menor índice de proliferación celular (p<0,001) y en esa misma localización en el tercio superior glandular es donde existe mayor índice de apoptosis (p=0,009). -Pólipos sin cáncer focal: los pólipos con diploidia son los que presentan mayor índice de apoptosis (p=0,05). Globalmente el I.A es mayor en la zona superior glandular y disminuye de forma progresiva hasta ser mínimo en la zona inferior (p<0,001). La mayor distribución de la apoptosis corresponde a la zona superior de los pólipos con displasia moderada y a la zona inferior de los pólipos de entre 1 y 2 cm. (p=0,02). -Pólipos con cáncer focal: en menores de 65 años presentan mayor índice de apoptosis (p=0,02). Globalmente el IA es mayor en la zona inferior (p=0,014). No hay relación entre la distribución de la apoptosis y las variables clínico-demográficas y anatomopatológicas tanto en la porción adenomatosa como en la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal. Al comparar entre sí la porción adenomatosa y la tumoral, el mayor índice de proliferación (mayor % fase S) corresponde a la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal invasor (p=0,039); no hay diferencias significativas en la distribución y el índice de apoptosis. Los pólipos con cáncer focal intramucoso con histología túbulo-vellosa son los que tienen mayor IA (p=0,035). En los pólipos con cáncer focal invasor los mayores índices de apoptosis se observan en aquellos con histología túbulo-vellosa (p=0,03), tamaño menor de 1cm (p=0,002) y menores de 65 años (p=0,02). -Comparación mucosa normal versus pólipos sin y con cáncer focal: el mayor índice de proliferación se obtiene en el grupo de pólipos con cáncer focal y los subgrupos intramucoso e invasor tanto en sus porciones adenomatosas como tumorales (p<0,001). El índice de apoptosis total, por zonas, y la distribución de la apoptosis por zonas son mayores en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001). -Comparación mucosa normal versus pólipos sin cáncer focal: los pólipos sin cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, siendo ésta una variable predictiva independiente (p<0,001). La distribución de la apoptosis por zonas y el índice de apoptosis total y por zonas también es mayor en los pólipos sin cáncer focal pero en este caso sólo tienen valor predictivo independiente en los tercios medio (p<0,001) e inferior (p=0,001). -Comparación mucosa normal versus pólipos con cáncer focal: los pólipos con cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, tanto en porción adenomatosa como tumoral, que el grupo de muestras normales, con valor predictivo independiente (p=0,003). La distribución y el índice de apoptosis, ambos por zonas, son mayores en la zona superior del grupo de muestras normales (p=0,007) y en la zona inferior del grupo de pólipos con cáncer focal (p=0,007). Dichas variables tienen valor predictivo independiente. -Comparación entre pólipos adenomatosos versus pólipos con cáncer focal: los segundos presentan mayor porcentaje de aneuploidia (p<0,001), sin diferencias en cuanto al índice de proliferación. El IA total es superior en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001), al igual que la distribución e IA en los tercios superior y medio (p<0,001), con valor predictivo independiente tanto si se considera la parte adenomatosa como la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal. La menor apoptosis en el tercio superior de los pólipos con cáncer focal presupone transformación maligna. Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte adenomatosa de los pólipos con cáncer focal, las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,027), displasia severa (p=0,036) y presencia de aneuploidia (p=0,043) tienen valor predictivo independiente, sugiriendo la presencia de transformación maligna. Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal sólo las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,017) y presencia de aneuploidia (p=0,005) tienen valor predictivo independiente para indicar transformación maligna. CONCLUSIONES El mayor porcentaje de células en fase S junto con la aneuploidia constituyen un indicador precoz, con valor predictivo independiente, de transformación maligna de los pólipos colorrectales. Los pólipos con cáncer focal, intramucoso o invasor, presentan un índice de apoptosis mayor en la zona inferior glandular, convirtiéndose en una variable con valor predictivo independiente de transformación maligna. Las variables tamaño > 2 cm., displasia severa, aneuploidia y mayor índice de apoptosis en la zona inferior glandular, todas ellas con valor predictivo independiente, permiten diferenciar entre los pólipos con y sin cáncer focal. La inhibición de la apoptosis favorece el crecimiento de los pólipos colorrectales así como su transformación maligna.