Modulació de l'autofàgia com a nova estratègia terapèutica en el melanoma. Estudi de les resistències a fàrmacs convencionals

Resumen

El melanoma és una neoplàsia maligna derivada dels melanòcits que, un cop disseminada, desenvolupa una gran resistència a la quimioteràpia i s’associa amb un mal pronòstic. Al voltant del 50% dels melanomes porten la mutació BRAFV600E. Els inhibidors de la quinasa BRAF, com el Vemurafenib, redueixen la càrrega tumoral en el melanoma disseminat. No obstant això, la resistència adquirida es produeix molt sovint i els tumors comencen a progressar sota el tractament. En estudis previs, hem demostrat que els canals de calci tipus T (TTCCs) estan sobreexpressats en cèl•lules de melanoma i tenen un paper important en la progressió tumoral. A més, hem descrit que els inhibidors farmacològics dels TTCCs (Mibefradil i Pimozide) redueixen la proliferació i desregulen l'autofàgia induint apoptosi. En la primera part d’aquest treball, hem analitzat el paper de l'autofàgia durant la migració e invasió en el melanoma. Els TTCCs Cav3.1 i la proteïna LC3II estan altament expressats en els melanomes BRAFV600E en comparació amb les línies cel•lulars o biòpsies que presenten la mutació NRASQ61. Per altra banda, hem constatat que el bloqueig farmacològic o el silenciament gènic dels TTCCs i la Cloroquina, inhibeixen el flux autofàgic i dificulten les capacitats d'invasió i migració cel•lulars, específicament en cèl•lules de melanoma amb la mutació BRAFV600E. Atès que Snail1 és un factor de transcripció amb un paper important en la motilitat i la invasió de les cèl•lules de melanoma, hem demostrat que Snail1 està fortament expressat en les línies cèl•lulars i en biòpsies de melanoma BRAFV600E i la seva expressió disminueix quan l'autofàgia està bloquejada. En la segona part del treball, hem investigat l'impacte de la inhibició dels TTCCs com a fàrmacs potencials per a superar la resistència adquirida als inhibidors de BRAF en els melanomes BRAFV600E. Els resultats ens indiquen que els nivells de TTCCs Cav3.1 estan incrementats en totes les línies cel•lulars resistents a Vemurafenib i en biòpsies de melanoma humà en comparació amb les seves parentals corresponents. A més, tant en les cèl•lules resistents com en les biòpsies, s’han observat nivells proteics de LC3 superiors, resultant en un augment de l'autofàgia basal. Particularment, l’inhibidor dels TTCCs, Mibefradil, indueix apoptosi i disminueix les taxes de migració e invasió mitjançant el bloqueig de l'autofàgia també en les cèl•lules resistents in vitro i en xenògrafts de ratolins in vivo. Per altra banda, la teràpia combinada (Vem + Mib) redueix o rescata la viabilitat cel•lular i les taxes de migració e invasió segons l'estat funcional de PTEN. Així doncs, quan PTEN no és funcional, s’observa un retràs en la inducció de mort i la inhibició de la migració cel•lular amb la teràpia combinada en les línies resistents a Vemurafenib. Finalment, el Mibefradil inhibeix l'adquisició de resistència en les cèl•lules de melanoma BRAFV600E en combinació amb el Vemurafenib. En conjunt, els nostres resultats suggereixen l’ús dels inhibidors dels TTCCs com dianes terapèutiques estratègiques per a combatre la resistència adquirida als inhibidors de BRAF en els melanomes humans. En la tercera part d’aquest treball, hem avaluat el potencial terapèutic de l’anticòs neutralitzant de M-CSF durant l'adquisició de resistència de les cèl•lules de melanoma BRAFV600E mitjançant l’ús de medis condicionats. En primer lloc, el secretoma dels medis de cultius de cèl•lules resistents a Vemurafenib indueix resistència al tractament i modula el fenotip de les cèl•lules parentals. A més, hem observat que el secretoma de les cèl•lules resistents presenta un increment de la secreció de citoquines pro-tumorals, entre les que s’inclou M-CSF, la qual promou l'adquisició de resistència en melanomes BRAFV600E amb PTEN no funcional (knockout o mutació). Per altra banda, el plasma de ratolins amb tumors subcutanis de cèl•lules resistents, indueixen un fenotip de resistència a les cèl•lules parentals in vitro. En conseqüència, la neutralització de la citoquina secretada M-CSF, mitjançant l’anticòs monoclonal, inhibeix l’adquisició del fenotip de resistència en les cèl•lules de melanoma BRAFV600E amb PTEN no funcional. El melanoma es una neoplasia maligna derivada de los melanocitos que, una vez diseminada, desarrolla una gran resistencia a la quimioterapia y se asocia con un mal pronóstico. Alrededor del 50% de los melanomas llevan la mutación BRAFV600E. Los inhibidores de la quinasa BRAF, como Vemurafenib, reducen la carga tumoral en el melanoma diseminado. Sin embargo, la adquisición de la resistencia se produce muy a menudo y los tumores comienzan a progresar bajo el tratamiento. En estudios previos, hemos demostrado que los canales de calcio tipo T (TTCCs) están sobreexpresados en células de melanoma y tienen un papel importante en la progresión tumoral. Además, hemos descrito que los inhibidores farmacológicos de los TTCCs (Mibefradil y Pimozide) reducen la proliferación y desregulan la autofagia induciendo apoptosis. En la primera parte de este trabajo, hemos analizado el papel de la autofagia durante la migración e invasión en el melanoma. Los TTCCs Cav3.1 y la proteína LC3II están altamente expresados en los melanomas BRAFV600E en comparación con las líneas o biopsias que presentan la mutación los NRASQ61. El el bloqueo farmacológico o el silenciamiento génico de los TTCCs y la Cloroquina, inhiben el flujo autofágico y dificultan las capacidades de migración e invasión, específicamente en células de melanoma BRAFV600E. Dado que Snail1 tiene un papel importante en la motilidad y la invasión de las células de melanoma, hemos demostrado que Snail1 está fuertemente expresado en las líneas celulares y biopsias de melanoma BRAFV600E y su expresión disminuye cuando la autofagia está bloqueada. En la segunda parte del trabajo, hemos investigado el impacto de la inhibición de los TTCCs como fármacos potenciales para superar la resistencia adquirida a los inhibidores de BRAF en los melanomas BRAFV600E. Los resultados indican que los niveles de TTCCs Cav3.1 están incrementados en todas las líneas celulares resistentes a Vemurafenib y en biopsias de melanoma humano en comparación con sus parentales correspondientes. Además, tanto en las células resistentes como en las biopsias, se observaron niveles proteicos de LC3 superiores, resultando en un aumento de la autofagia basal. Particularmente, el inhibidor de los TTCCs, Mibefradil, induce apoptosis y disminuye las tasas de migración mediante el bloqueo de la autofagia también en las células resistentes in vitro y en xenografs de ratones. Por otra parte, la terapia combinada (Vem + Mib) reduce o rescata la viabilidad celular y las tasas de migración e invasión según el estado funcional de PTEN. Así pues, cuando PTEN no es funcional, se observa un retraso en la inducción de muerte y la inhibición de la migración celular con la terapia combinada en las líneas resistentes a Vemurafenib. Finalmente, el Mibefradil inhibe la adquisición de resistencia en las células de melanoma BRAFV600E en combinación con Vemurafenib. En conjunto, nuestros resultados sugieren el uso de los inhibidores de los TTCCs como dianas terapéuticas estratégicas para combatir la resistencia adquirida a los inhibidores de BRAF en los melanomas humanos. En la tercera parte del presente trabajo, hemos evaluado el potencial terapéutico del anticuerpo neutralizante de M-CSF durante la adquisición de resistencia de las células de melanoma BRAFV600E mediante el uso de medios condicionados. En primer lugar, el secretoma de los cultivos celulares células resistentes a Vemurafenib induce resistencia al tratamiento y modula el fenotipo de las células parentales. Además, hemos observado que el secretoma de las células resistentes presenta un incremento de la secreción de citoquinas pro-tumorales entre las que se incluye M-CSF, que promueve la adquisición de resistencia en melanomas BRAFV600E con PTEN no funcional (knockout o mutación). Además, el plasma de ratones con tumores subcutáneos de células resistentes, inducen un fenotipo de resistencia a las células parentales in vitro. En consecuencia, la neutralización de M-CSF, mediante el anticuerpo monoclonal, inhibe la adquisición del fenotipo de resistencia en las células de melanoma BRAFV600E con PTEN no funcional. Melanoma is a malignant neoplasia derived from melanocytes that once disseminated becomes highly resistant to chemotherapy and associates with poor prognosis. Around 50% of melanomas carry the BRAFV600E mutation. Targeting BRAF mutant kinase by inhibitors, such as Vemurafenib, reduce tumor burden in disseminated melanoma. However, acquired resistance very frequently develops and tumors begin to progress under treatment. In previous studies, we have reported that T-type calcium channels (TTCCs) are overexpressed in melanoma cells and play an important role in melanoma progression. Importantly, TTCC pharmacological blockers (Mibefradil and Pimozide) reduce proliferation and deregulate autophagy leading to apoptosis. Therefore, in the first part of this work, we analyzed the role of autophagy during migration and invasion processes of melanoma cells. TTCCs Cav3.1 and LC3II protein are highly expressed in BRAFV600E both in cell lines and biopsies compared to NRASQ61 mutant melanomas. Pharmacological blockade or gene silencing of TTCCs and Chloroquine, inhibit the autophagic flux and impair the migration and invasion capabilities, specifically in BRAFV600E melanoma cells. Because of Snail1 plays an important role in motility and invasion of melanoma cells, we showed that Snail1 is strongly expressed in BRAFV600E melanoma cells and patient biopsies, and its expression decreases when autophagy is blocked. In the second part of this work, we investigated the impact of inhibiting TTCCs as a target to overcome acquired resistance to BRAFi in BRAFV600E melanomas. Results indicate that TTCCs Cav3.1 is highly expressed in all Vemurafenib resistant (Vem-R) melanoma cell lines and human melanoma biopsies compared to their parental counterparts. Besides, in Vem-R cells or biopsies, we observed higher LC3 protein levels, in turn, increased autophagy. Particularly, TTCC blocker, Mibefradil, induces apoptosis and impaired migration rates while inhibiting autophagy in Vem-R cells in vitro and in mouse xenografts in vivo. In addition, combination therapy (Vem+Mib) reduced or rescued cell viability and migration/invasion rates depending on PTEN status. Therefore, when PTEN is non-functional, there is a delay in the death induction and an inhibition of cell migration in combination therapy in Vemurafenib-resistant lines. Finally, Mibefradil inhibits the acquisition of resistance in BRAFV600E melanoma cells in combination with Vemurafenib. Taken together, our results suggest TTCC blockers as targetable to overcome acquired resistance to BRAF inhibitors in human melanomas. In the third part of the present word, we have evaluated the therapeutic potential of M-CSF neutralizing antibody during resistance acquisition of melanoma cells by conditioned media. First, tumor microenvironment of cell cultures from resistant melanomas induces therapy resistance and modulates the phenotype of parental cells. Furthermore, we have observed that Vem-R secretoma presents an increase of pro-tumor cytokines secretion, including M-CSF that promotes the acquisition of resistance in BRAFV600E melanomas with loss of PTEN (knockout o mutation). On the other hand, plasma mice from subcutaneous tumors of resistant cells induce a resistance phenotype to parental cells in vitro. Consequently, M-CSF neutralization by monoclonal antibody inhibits resistance development in melanomas BRAFV600E with PTEN non-functional.