Estudio de limpii y ctla4 como adyuvantes en_vacunas de adn para la prevención de la diabetes tipo i

Resumen

La diabetes tipo I (DT1) es una enfermedad metabólica autoinmune en la cual se produce la destrucción selectiva de las células ¿ de los islotes pancreáticos de Langerhans, debido a una infiltración de los islotes por parte de células de sistema inmune, tales como células T CD4 y CD8, células B, macrófagos, células NK, etc. Esta destrucción conlleva desajustes en los niveles de insulina, con consecuencias patológicas graves tales como la hiperglucemia o la cetosis. A pesar de la alta incidencia de la DT1 en población mundial, alrededor del 0,4%, aún no están claros los mecanismos celulares y moleculares asociados a la desarrollo de la enfermedad, pero se sabe que tanto factores genéticos como ambientales están involucrados en la patogénesis. En los últimos años se ha avanzado en el conocimiento de la enfermedad gracias al uso de un modelo animal experimental, el ratón NOD (Non-Obese Diabetic), que desarrolla espontáneamente diabetes autoinmune de forma similar a la DT1 en humanos. La implicación de las células T CD4 en la patogénesis de la enfermedad se pone de manifiesto por la asociación de ciertos alelos de MHC de clase II al desarrollo de la enfermedad tanto en humanos como en el modelo NOD. En este último caso, la enfermedad está claramente asociada a la presencia de la molécula de clase II I-Ag7. A partir de ratones NOD transgénicos se aislaron clones de células T CD4 autorreactivas, siendo el clon diabetogénico BDC2.5 uno de los mejores caracterizado, incluso su TCR ha sido utilizado para generar ratones transgénicos. Uno de los principales objetivos en el desarrollo de terapias para la DT1 consiste en el uso de estrategias basadas en la eliminación o modificación de las células autorreactivas, ya que estas aproximaciones evitarían las complicaciones clínicas que acompañan a las terapias que inducen supresión inmune general. Se ha demostrado que el uso de autoantígenos o péptidos derivados de los mismos, son capaces de inducir tolerancia específica en diferentes modelos experimentales mediante mecanismos tales como anergia, deleción, supresión o desvío de fenotipo. En este trabajo estudiamos el uso de dos vacunas de ADN que codifican para un péptido mimótopo del clon BDC2.5 denominado 2.5mi fusionado a la secuencia señal de la proteína LIMP II o a CTLA4-Ig. Ambos constructos direccionan al péptido, aunque de diferente manera, al compartimiento lisosomal de las células presentadoras de antígenos, en el cual se cargan las moléculas de MHC de clase II. Analizamos el efecto de los plásmidos sobre la diabetes en la cepa de ratones NOD y estudiamos los posibles mecanismos de acción de los tratamientos, analizando la capacidad de dichos plásmidos para inducir cambios cuantitativos y cualitativos en la población de células T CD4+ 2.5mi+ natural presente en ratones de la cepa NOD y otras poblaciones de interés. Los resultados obtenidos fueron que el plásmido pCMV-2.5mi-LIMPII induce proliferación de la población de células T CD4 específicas en bazo y nódulos drenantes de ratones NOD tras recibir 3 dosis intramusculares. El plásmido pCMV-CTLA4-Ig-2.5mi induce proliferación de las células T CD4 específicas sistémicamente excepto en nódulos pancreáticos de ratones NOD tratados con una dosis intramuscular y en menor medida con 3 dosis. El plásmido pCMV-2.5mi-LIMPII protege específicamente a los ratones NOD contra el desarrollo de la diabetes autoinmune cuando son tratados con 3 dosis del mismo a la edad de 4 semanas, disminuyendo la incidencia a la mitad comparado con el plásmido control o con animales sin tratar. Tanto el plásmido pCMV-CTLA4-Ig-2.5mi como un plásmido control protegen de forma similar a los ratones NOD contra el desarrollo de la diabetes autoinmune cuando son tratados con 3 dosis de los mismos a la edad de 7 semanas, siendo la protección inferior a la observada con el plásmido pCMV-2.5mi-LIMPII, en este caso la incidencia disminuye de 80% en el grupo control sin tratar a aproximadamente 60% en los grupos tratados con los plásmidos. El plásmido pCMV-CTLA4-Ig-2.5mi protege específicamente a los ratones NOD contra el desarrollo de la diabetes autoinmune cuando reciben un tratamiento continuo del mismo, disminuyendo la incidencia de 60% a 40% comparado con el plásmido control y de 80% a 40% al ser comparado con el grupo control sin tratar. Las células B no parecen tener un rol fundamental en la presentación del péptido 2.5mi expresado a partir de los plásmidos pCMV-2.5mi-LIMPII o pCMV-CTLA4-Ig-2.5mi. Las células dendríticas parecen tener un rol en la presentación del péptido expresado a partir del plásmido pCMV-CTLA4-Ig-2.5mi, que además, no induce maduración de las células dendríticas. Tanto el plásmido pCMV-2.5mi-LIMPII como pCMV-CTLA4-Ig-2.5mi no inducen anergia ni cambio de fenotipo de Th1 a Th2 de la población de células T CD4+ específicas. El plásmido pCMV-2.5mi-LIMPII no induce proliferación de la población de células Treg totales o específicas pero provoca cambios funcionales no determinados en estas células que podrían mediar la protección. El plásmido pCMV-CTLA4-Ig-2.5mi puede inducir proliferación de la población de células Treg específicas que podrían mediar la protección.