Redesigning rice for environmental sustainability, enhanced productivity and specialty uses

Resumen

Conseguí dirigir la proteína verde fluorescente codificada en el núcleo (eGFP) a las mitocondrias de arroz utilizando seis pre-secuencias mitocondriales con diverso orígen filogenético. Investigué su efectividad mediante análisis de inmunotransferencia, microscopía confocal y electrónica tanto en callos como en plantas regeneradas. Confirmé que los péptidos COX4, SU9 dirigían eficazmente eGFP a las mitocondrias de arroz independientemente de su origen. Utilicé esta metodología para diseccionar y expresar la proteína NifH nitrogenasa Fe, extremadamente sensible al oxígeno, y su maturasa NifM en las mitocondrias de arroz, superando así el cuello de botella más desafiante de la ingeniería de la fijación biológica de nitrógeno en los cereales. Por lo tanto, pude expresar y purificar cantidades sustanciales de NifH a partir de callos de arroz y confirmé que la NifH aislada desempeñaba el papel fundamental de la actividad emzimática de NifH necesaria para diseñar la fijación de nitrógeno, incluida la transferencia de electrones y la biosíntesis de FeMo-co. De esta manera pude demostrar, por primera vez, la expresión y actividad estables de un componente nitrogenasa en cualquier cereal. También usé CRISPR / Cas9 para mutar el OsSBEIIb (que codifica la enzima ramificadora de almidón IIb), que se requiere para la síntesis de amilopectina densamente ramificada en el endospermo del arroz. Investigué los efectos de la inactivación de la enzima de biosíntesis de almidón individual en el almidón de arroz y en su metabolismo general. Las plantas mutantes homocigotas, en las que OsSBEIIb estaba completamente inactivado, produjeron semillas opacas con reservas de almidón agotadas cuyo contenido de amilosa aumentó de 19.6 a 27.4% y el contenido de almidón resistente (RS) aumentó de 0.2 a 17.2%. Debido a la mutación, hubo un aumento general en la acumulación de azúcares, ácidos grasos, aminoácidos y fitoesteroles en el endospermo mutante, lo que sugiere que los intermediarios en la vía de biosíntesis del almidón aumentaron el flujo a través de vías indirectas causando un profundo impacto en la acumulación de múltiples metabolitos primarios y secundarios.