Anàlisi quantitatiu de l’efecte de l’expressió d’una lipasa recombinant sobre el metabolisme central de Pichia pastoris

Resumen

La determinació de fluxos metabòlics constitueix una eina fonamental per a l'anàlisi quantitativa de la fisiologia cel·lular, ja que ens proporciona una mesura del grau d’implicació de les diverses vies en els processos metabòlics així com una visió general del comportament cel·lular. La quantificació exacta de la magnitud dels fluxos de cadascuna de les diferents vies “in vivo” és, per tant, un objectiu important de la fisiologia cel·lular i l'enginyeria metabòlica, especialment en el context de la biotecnologia industrial, l'objectiu principal de la qual és maximitzar la producció del compost d’interès, com ara la producció de compostos químics, biopolímers o d’altres compostos bioactius com ara les proteïnes. Aquest projecte de recerca s’ha dirigit a contribuir a una millor comprensió de la fisiologia del llevat metilotròfic Pichia pastoris sota l’estrès ocasionat per la producció de proteïnes recombinants. Concretament, aquesta tesi s'ha centrat en l'anàlisi sistemàtica del metabolisme cel·lular a nivell fluxomic i metabolòmic, i com aquests conjunts de dades de diferents nivells poden integrar-se i contribuir a la comprensió dels efectes de la càrrega metabòlica potencialment imposada per la secreció d'una proteïna recombinant i l’efecte del tipus de font de carboni utilitzat. En el Capítol 2, s’obtingué una descripció consistent de la composició principal de la biomassa de P. pastoris per a cada condició de cultiu realitzada en aquest estudi. Els resultats obtinguts han estat utilitzats en els capítols següents per realitzar l'anàlisi de fluxos metabòlics. En el Capítol 3, es realitzaren experiments amb marcatge 13C fraccional biosintèticament dirigit (BDF). Els experiments es realitzaren en cultius operats en continu de P. pastoris creixent amb barreges de glucosa/metanol com a font de carboni, per tal d’obtenir informació sobre les relacions entre fluxos de les principals vies metabòliques del metabolisme central d'aquest llevat. Es desenvoluparen noves equacions pel cas de la mescla de font de carboni mixta glucosa/metanol utilitzada. Seguidament, aquestes relacions foren utilitzades per dur a terme l'anàlisi de fluxos metabòlics de les diferents soques de P. pastoris secretores d'una lipasa recombinant (les quals tenien 1 i 2 còpies del gen que codifica la lipasa). La principal característica obtinguda, reflectida en els diferents quocients de fluxos metabòlics i les dades macroscòpiques dels cultius, fou la similitud en les estimacions finals de fluxos entre les dues soques productores de lipasa. No obstant, s’observaren diferències estadísticament significatives al comparar ambdues soques amb la soca control de referència (no productora). Durant el Capítol 4, seguint la mateixa metodologia comentada en el capítol anterior, s’estudià l’efecte de la taxa de dilució i diferents relacions de barreges glicerina/metanol com a font de carboni en cultius en continu de P. pastoris amb una única còpia del gen de la lipasa . Concretament, es realitzaren cultius a dues velocitats de dilució per tal d’avaluar l'impacte combinat de la composició de les diferents mescles de fonts de carboni i velocitat de creixement sobre la distribució de fluxos intracel·lulars. Les dades experimentals obtingudes en aquest estudi es combinaren amb dades de marcatge 13C obtingudes en experiments previs sota les mateixes condicions. No obstant, com a conseqüència de la utilització de glicerina en lloc de glucosa, no fou possible la utilització de les equacions de flux formulades en el capítol anterior. Per tant, com a solució alternativa, s’implementà una metodologia basada en l'avaluació global de la xarxa metabòlica per tal de calcular la distribució de fluxos. Curiosament, no s’observaren diferències estadísticament significatives en la distribució de fluxos quan es compararen els diferents cultius amb diferent relació de glicerina/metanol realitzats sota la mateixa taxa de dilució. D’altra banda, si que s’observaren clares diferències en el moment de comparar els patrons de flux corresponents a diferents taxes de dilució. Les diferents anàlisis metabolòmiques es descriuen en els Capítols 4 i 5. En el Capítol 5, s’aplicà una anàlisi metabolòmica juntament amb una distribució de fluxos en condicions isotopomèriques no estables (condicions de marcatge 13C en dinàmic) per a caracteritzar el metabolisme central de carboni de la soca de referència (control) de P. pastoris creixement amb glucosa/metanol com a font de carboni mixta. Una nova metodologia basada en les dades de marcatge obtingudes mitjançant GC-MS i LC-MS ens va permetre una quantificació més precisa dels diferents fluxos metabòlics per a les vies de les pentoses fosfat, la glucòlisi i la via d'assimilació del metanol. Posant com a referència els resultats obtinguts en el capítol 3, aquesta nova metodologia permeté determinar una distribució de fluxos més amplia i acurada. Així mateix, es realitzà una anàlisi termodinàmica de les dades de metabolòmica , la qual ens va permetre validar les concentracions de metabòlits mesurades i les direccions dels fluxos calculades. Finalment, en el Capítol 6, es realitzà una comparació fluxòmica i metabolòmica entre les diferents soques utilitzades en aquesta tesi, a més a més d'una altra soca amb més de 2 còpies del gen de la lipasa disponible en el Grup de recerca. Els resultats obtinguts no mostraren diferències estadísticament significatives entre les diferents soques productores en termes de distribució global dels fluxos. Ara bé, s'observaren diferències locals estadísticament significatives en alguns punts de la xarxa metabòlica. A més, l'anàlisi metabolòmica, revelà diferències clares entre la soca control i la productora, com ara la concentració de trehalosa, metabòlit estretament lligat a respostes d’estrès. En general, durant aquesta tesi s’ha portat a terme amb èxit la implementació de noves metodologies per a l'anàlisi dels fluxos metabòlics de P. pastoris. Aquestes metodologies han estat comparades i posteriorment validades. A més a més, utilitzant les diferents dades metabolòmiques obtingudes, ens ha permès expandir la xarxa metabòlica proposada durant els primer capítols d’aquesta tesi, ampliant així el coneixement sobre l’impacte de producció d’una proteïna recombinant sobre el metabolisme central del carboni de P. pastoris creixent sobre fonts de carboni mixtes.