Ribonucleotidil Reductases de Salmonella enterica serovar TyphimuriumRegulació Transcripcional i Participació en la Patogènesi

Resumen

Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) és un patògen intracel·lular gram negatiu que provoca gastroenteritis en humans però que en ratolins provoca una infecció sistèmica similar a la febre tifoidea humana (provocada en aquest cas per S. Typhi). Una de les característiques principals de la infecció per S. enterica és la capacitat que presenta per envair activament cèl·lules epitelials i sobreviure i proliferar a l'interior dels macròfags.S. Typhimurium presenta codificades en el seu genoma tres tipus de ribonucleotidil reductases (RNRs): classe Ia, Ib i III. Les RNRs són enzims essencials ja que són els responsables de la síntesi de novo dels desoxirribonucleòtids (dNTPs), necessaris per a la síntesi i reparació del DNA, a partir de la reducció dels ribonucleòtids (NTPs). Fins ara s'han descrit tres classes de RNRs que es diferencien pel mecanisme de generació del radical que utilitzen, l'estructura que presenten, la seva regulació al·lostèrica i la seva dependència de l'oxigen. Tot i així, totes tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical lliure orgànic per a iniciar la catàlisi.En aquest treball s'ha estudiat la regulació transcripcional de les tres classes de RNRs presents en S. Typhimurium, centrant-nos en dos reguladors: NrdR i Fur. S'ha estudiat l'efecte de la deleció de NrdR sobre l'expressió gènica de les tres classes de RNRs. NrdR és un repressor de les tres classes de RNRs i presenta un major efecte sobre l'expressió de l'operó nrdHIEF. També s'han descrit les seves caixes d'unió i s'han obtingut proteïnes mutants en determinats residus que afecten la funcionalitat de NrdR in vivo, possiblement degut a la participació d'aquests residus en la unió de dATP/ATP. La mutació de Fur provoca un agument de l'expressió de l'operó nrdHIEF de fins a cinc vegades respecte la soca salvatge. A la regió promotora de l'operó nrdHIEF hi hem detectat una possible caixa d'unió de Fur, la mutació de la qual provoca un augment en l'expressió similar a l'observat en la soca amb Fur delecionat. Mitjançant assajos de retardament electroforètic hem confirmat la unió de Fur a la regió promotora de l'operó nrdHIEF.En condicions normals, S. Typhimurium utilitza la RNR de la classe Ia per a la síntesi de novo de desoxirribonucleòtids en presència d'oxígen. La classe Ia és essencial per al seu creixement i la classe Ib no és capaç de complementar-ne la seva mutació a no ser que se li introdueixi una còpia extra. La presència de dues RNRs amb activitats redundants en un mateix microorganisme, el fet que en altres espècies bacterianes la síntesi de desoxirribonucleòtids en presència d'oxigen la dugui a terme la classe Ib, i que tant en E. coli com S. Typhimurium la classe Ib s'hagi conservat al llarg de l'evolució fa pensar que aquesta classe de RNR ha d'expressar-se en algunes condicions molt concretes de creixement.En aquest treball s'ha estudiat la participació de les RNRs en la virulència de S. Typhimurium SL1344 mitjançant la construcció de mutants de cada una de les tres classes així com de dobles mutants i mutants en els seus reguladors (Fur, NrdR). Mitjançant assajos d'infecció de línies cel·lulars de macròfags i també de cèl·lules epitelials hem intentat desvetllar quina de les RNRs és la responsable del creixement de S. Typhimurium durant el procés d'infecció. Els resultats obtinguts indiquen que la RNR responsable de la invasió i de la proliferació a l'interior de macròfags és la classe Ia, mentre que les classes Ib i III no semblen ser essencials. No obstant, observant el comportament de la soca mutant en la classe Ia que presenta la classe Ib sobreexpressada, durant les primeres hores d'infecció (2-6 h) sí que és capaç de sobreviure. Creiem que en aquesta etapa inicial de la infecció, quan es produeix l'explosió respiratoria, es generen unes condicions que activen l'expressió de l'operó nrdHIEF, possiblement la concentració de peròxid d'hidrogen és capaç d'inhibir l'activitat repressora de Fur. La gran demanda de dNTPs a causa del dany al DNA que s'està produint fa necessari un subministrament extra de dNTPs que aportarà la reductasa NrdEF.