Millora de la resistència dels agents de biocontrol "candida sake cpa-1" "pantoea agglomerans cpa-2" a condicions d'estrés ambiental

Resumen

La aplicabilidad real de los agentes de control biológico depende, en gran medida, de lograr incrementar el rango de condiciones en los que éstos son efectivos, además de ampliar el espectro de acción a nuevos huéspedes y enfermedades. También son premisas obligatorias para garantizar su futuro, presentarlos bajo una formulación estable, con un elevado número de células viables, que mantenga su eficacia y económicamente viables des un punto de vista industrial. Desgraciadamente, o bien cuando los agentes de biocontrol se aplican a nuevas condiciones y nuevos huéspedes, como cuando se someten a los procesos de formulación, estos son expuestos a condciones ambientales adversas que afectan su viabilidad y comprometen su eficacia. Los agentes de postcosecha de fruta de pepita en el primer de los casos y fruta de pepita y cítricos en el segundo. Teniendo en cuenta los objetivos anteriormente comentados, en esta tesis se planteó el objetivo general de inducir respuestas de estrés en estos agentes de autocontrol, y estudiar si esta inducción comporta una mayor adaptación y/o resistencia de dichos agentes a las condiciones adversas que se dan en las situaciones prácticas de aplicación. Este objetivo general se llevó a cabo mediante los siguientes objetivos específicos: (1) induciendo respuestas de adaptación en el agente de biocontrol P. agglomerans a condiciones de baja (aw) (Capítulo i), bajo pH (Capítulo IV) y altas temperaturas (Capítulo V) y en C. sake induciendo respuestas de adaptación a altas temperaturas (Capítulo VI). (2) Con vistas a una investigación futura, también se analizaron los mecansimos de adaptación de estos agentes de biocontrol frente a las condiciones de estrés estudiadas y se determinaron los principales solutos compatibles, solutos y proteínas acumulados por parte de la célula en situaciones de estrés (Capítulo III y Capítulo IV). A continuación se determinó el efecto de la inducción de respuestas de adaptación sobre la viabilidad de las células en condiciones prácticas de aplicación. Así, (3) se determinó el efecto de los tratamientos osmóticos y de combinar tratamientos osmóticos y térmicos en P. agglomerans sobre la viabilidad de las células durante el proceso de deshidratación por atomización (Capítulo I), en el primer caso, y en lecho fluidizado (Capítulo V) en el segundo caso. Respecto a C. sake se determinó el efecto de la termoadaptación de las células de C. sake sobre la viabilidad de las células durante el proceso de deshidratación por atmización (Capítulo VI). Finalmente, (4) se estudió el efecto de la osmoadaptación de P. agglomerans y la termoadaptación en C. sake, en combinación con otras estrategias de mejora de las formulacione sobre la viabilidad de las poblaciones aplicadas en condiciones de campo y consiguientemente sobre la efectiidad frente a P. digitatum y P. italicum en cítricos, en el caso de P. agglomerans (Capítulo VIII) y frente a Botrytis cinerea en uva para vinificación en el caso de C. sake (Capítulo IX). Los resultados mostraron que una pre-adaptación de P. agglomerans a condiciones de pH 5 usando ácido málico o cítrico producían células ácido resistentes. De la exposición de P. agglomerans a altas temperaturas (35º C o 40º C) o bajas aw en presencia de NaCI también se obtuvieron células más resistentes, e incluso en algunos casos, se observó la inducción de resistencias cruzadas. El compuesto glicina-betaina se mostró como uno de los principales solutos utilizados por P. agglomerans como mecanismo de adaptación a bajas aw en presencia de NaCI, confiriendo su acumulación una mayor osmoresistencia a las células. De los aminoácidos determinados, glutamina, ácido aspártico, ácidoglutámico, glicina, serina, alanina, prolina, lisina y cadaverina, parece ser que no son responsables de la mayor osmoadaptación, termotolerancia, o resistencia a condiciones de bajo pH mostrada por las células pre-adaptadas de P. agglomerans. Respecto a C. sake también fue posible inducir termotolerancia a la temperatura subletal de 30º C como a 33º C. Por contra, ni la glucosa, trehalosa, glicerol, manitol, eritritol y arabitol, ni las proteínas de choque térmico parecen ser responsables directos de la termoresistencia mostrada por las células. En los estudios de formulación se observó que, tanto la termoadaptación de C. sake como la osmoadaptación de P. agglomerans, permitieron mejorar los porcentajes de viabilidad o supervivencia durante el proceso de atomización. En C. sake los mejores resultados se obtuvieron cuando los tratamientos de estrés se aplicaron a una temperatura de 33ºC desde incio o plena fase estacionaria de crecimiento hasta las 40 h de incubación. En P. agglomerans, los tratamientos osmóticos a aw de 0.98 y 0.97 en presencia de NaCI y después de 48 h de incubación mostraron los porcentajes de viabilidad más altos. Pese a ello, la técnica de deshidratación por atomización es adecuada para la formulación tanto de P. agglomerans comode C. sake debido a las bajas viabilidades obtenidas. En P. agglomerans, los tratamientos osmóticos a aw de 0.98 y 0.97 en presencia de NaCI y después de 48 h de incubación mostraron los porcentajes de viabilidad más altos en lecho fluido, con niveles de 46% y 33% respectivamente. Sin embargo, estos tratamientos mostraron niveles de crecimiento más bajos y tiempos de incubación excesivos para considerarlos interesantes desde un punto de vista industrial. No obstante, la relación mostrada entre la acumulación de glicina-betaina por parte de estos tratamientos y la mayor resistencia a la deshidratación en atomización o lecho fluido de los mismos, nos anima a seguir profundizando en los mecanismos de adaptación utilizados por las células en condiciones de estrés. Conocer estos mecanismos de adaptación nos pueden ayudar a controlar los procesos de producción con la finalidad de facilitar aquellas condiciones que induzcan una mayor acumulación intracelular de estos solutos compatibles o bien porque son directamente sintetizados o porque son captados directamente por parte de la célula desde el medio de cultivo. La combinación de tratamientos osmóticos con tratamientos de estrés de temperatura puntuales a 35ºC aplicados en el inicio de la fase estacionaria de crecimiento durante 1h o 3h sobre las células de P. agglomerans permitió obtener concentraciones de células viables entre 5.5 x 1010 y 1.1. x 1011 UFC g-1 en el producto final fluidizado, característica que hace del hecho fluido una técnica adecuada para la formulación de P. agglomerans. Finalmente, de los ensayos en campo con P. agglomerans concluimos que es posible controlar las principales enfermedades de postcosecha de cítricos mediante tratamientos aplicados en precosecha. Los resultados más destacados fueron que los tratamientos precosecha de P. agglomerans en los que se combinaron las tres estrategias de mejora propuestas, osmoadaptación y liofilización de las células, junto al uso del aditivo Fungicover (FC) a una concentración del 5%, aumentaron la persistencia de las poblaciones hasta al menos 20 días en condiciones de campo a niveles que oscilaron entre 2.0 y 2.7 log UFC cm-2. Estos tratamientos resultaron efectivos después de 15 días de conservación de los frutos a 20ºC y 80% HR con niveles de control de podridos equiparables a los mostrados en el tratamiento en postcosecha de P. agglomerans. Así, en infección natural sobre naranjas "Lane late" y "Valencia late" mostraron porcentajes de reducción de la podredumbre por encima del 58% y 72% respectivamente. En infección artificial resultaron efectivos frente a P. digitatum con niveles de reducción por encima del 65% en las dos variedades.